دانشگاه آزاد اسلامی
واحد علوم دارویی
دانشکده علوم وفناوری‌های نوین، گروه زیست شناسی
پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد((M.Sc))
گرایش: میکروبیولوژی
عنوان:
غربالگری اکتینومایست‌های نگهداری شده در کلکسیون میکروارگانیسم‌های دانشگاه تهران برای تولید ترکیبات ضد سرطان ریه
استاد راهنما:
جناب آقای دکتر جواد حامدی
اساتید مشاور:
جناب آقای دکتر سید مهدی رضایت سرخ آبادی
سرکار خانم دکتر فاطمه محمدی پناه
سال تحصیلی 92-1391
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکیده…………………………………………………………………………………………………………………………………………1
فصل اول: کلیات
1-1- سرطان……………………………………………………………………………………………………………………………….3
1-2- علل سرطان………………………………………………………………………………………………………………………..3
1-3- خصوصیات سلول توموری…………………………………………………………………………………………………..5
1-4- روش های درمان سرطان……………………………………………………………………………………………………..6
1-5- تاریخچه ی شیمی درمانی…………………………………………………………………………………………………. 6
1-6- مقاومت دارویی…………………………………………………………………………………………………………………..7
1-7- فارماکولوژی پایه داروهای شیمی درمانی سرطان…………………………………………………………………….8
1-7-1- داروهای آلکیله کننده………………………………………………………………………………………………………8
1-7-2- آنتی متابولیت‌ها……………………………………………………………………………………………………………..8
1-7-3- هورمون‌ها……………………………………………………………………………………………………………………..9
1-7-4- فراورده‌‌های گیاهی………………………………………………………………………………………………………….9
1-7-5- آنتی بیوتیک‌های ضدسرطان…………………………………………………………………………………………..10
1-7-5-1- اکتینومایسین…………………………………………………………………………………………………………..11
1-7-5-1-1- داکتینومایسین……………………………………………………………………………………………………..11
1-7-5-2-آنتراسیکلین………………………………………………………………………………………………………………13
1-7-5-2-1-دانوروبیسین………………………………………………………………………………………………………….14
1-7-5-2-2-دوکسوروبیسین هیدروکلراید…………………………………………………………………………………..16
1-7-5-3- میترامایسین………………………………………………………………………………………………………………17
1-7-5-4 بلئومایسین سولفات…………………………………………………………………………………………………….19
1-7-5-5- میتومایسین‌ها……………………………………………………………………………………………………………21
1-7-5-5-1 میترامایسین C………………………………………………………………………………………………………..22
1-7-5-6- استرپتوزوستین…………………………………………………………………………………………………………22
1-8-سرطان ریه………………………………………………………………………………………………………………………..23
1-8-1- علائم سرطان ریه……………………………………………………………………………………………………….. 26
1-8-2- سرطان در ایران…………………………………………………………………………………………………………… 26
1-9-اکتینومیست‌ها…………………………………………………………………………………………………………………….28
1-9-1-متابولیت‌های ثانویه‌ی اکتینومیست‌ها………………………………………………………………………………….30
1-10-هدف از پژوهش………………………………………………………………………………………………………………33
3-1- ترکیبات استفاده شده………………………………………………………………………………………………………….39
3-2- دستگاه های استفاده شده……………………………………………………………………………………………………42
3-3- سویه‌های اکتینومیست………………………………………………………………………………………………………..43
3-4- آماده‌سازی محیط کشت تولید اسپور باکتری………………………………………………………………………….43
3-5- آماده‌سازی محیط پیش کشت………………………………………………………………………………………………44
3-6- آماده‌سازی محیط کشت تخمیر……………………………………………………………………………………………44
3-7- احیا و کشت سویه…………………………………………………………………………………………………………….45
3-8- تهیه پیش کشت……………………………………………………………………………………………………………… 45
3-9- تولید متابولیت‌ها………………………………………………………………………………………………………………45
3-10- استخراج متابولیت‌ها………………………………………………………………………………………………………45
3-11- نگهداری عصاره‌ها………………………………………………………………………………………………………..46
3-12- غربالگری اولیه، ارزیابی فعالیت سمیت……………………………………………………………………………46
3-12-1- کشت آرتمیا……………………………………………………………………………………………………………..46
3-12-2- آزمون ارزیابی سمیت در آرتمیا…………………………………………………………………………………..47
3-13- غربالگری ثانویه، ارزیابی سمیت در کشت سلولی……………………………………………………………..48
3-13-1- انتخاب دودمان سلولی…………………………………………………………………………………………….. 48
3-13-1-1 محیط کشت………………………………………………………………………………………………………….49
3-13-1-1-1- مراحل تهیه محیط کشت دودمان سلولی A549…………………………………………………..49
3-13-1-1-2-تجدیدکشت دودمان سلولی A549……………………………………………………………………..50
3-13-1-1-3- شمارش سلول‌ها و بررسی میزان فعالیت سلول…………………………………………………..51
3-13-2- تهیه محلول تریپسین………………………………………………………………………………………………….52
3-14- آزمون MTT………………………………………………………………………………………………………………..53
3-15- شمارش سلول برای انجام آزمونMTT……………………………………………………………………………54
3-16- روش انجام آزمون MTT دراین پژوهش……………………………………………………………………….54
3-17- بررسی ریخت‌شناسی سلول‌ها تیمار شده با عصاره اکتینومیست‌ها……………………………………..55
3-18- شناسایی سویه‌های منتخب اکتینومیست………………………………………………………………………….56
3-18-1- بررسی مورفولوژی میکروسکوپی……………………………………………………………………………. 56
3-18-2- بررسی میسلیوم‌های هوایی و آرایش زنجیره اسپوری……………………………………………………56
3-18-3- بررسی رشد میسلیومی در محیطISP2 broth………………………………………………………………56
3-19- مطالعه شیمیوتاکسونومی………………………………………………………………………………………………56
3-19-1- تهیه بیومس برای تعیین ایزومر دی آمینوپامیلیک اسید(DAP)……………………………………………56
3-19-2- تعیین ایزومر DAPموجود در دیواره سلولی…………………………………………………………………… 57
3-20- شناسایی توالی نوکلئوتیدی ژن 16S rRNA سویه‌های منتخب…………………………………………….. 58
3-20-1- تهیه محیط کشت Luria Broth(LB)……………………………………………………………………………..58
3-20-2- تهیه زیست توده برای مطالعات فیلوژنتیک……………………………………………………………………..59
3-20-3- استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………………59
3-20-4- تائید بررسی کیفیت استخراج DNA………………………………………………………………………………61
3-20-4-1- تهیه ژل آگاروز……………………………………………………………………………………………………..61
3-20-4-1-1- تهیه بافر(TAE)Tris-Acetate-EDTA………………………………………………………………..61
3-20-5- انجام فرایند واکنش زنجیره پلیمراز(PCR)……………………………………………………………………..62
3-20-5-2- شرایط واکنش PCR………………………………………………………………………………………………62
3-20-5-3- بررسی محصولات PCR………………………………………………………………………………………..63
3-20-5-4- خالص سازی محصولات PCR……………………………………………………………………………….63
3-20-6- تعیین توالی نوکلئوتیدی قطعات تکثیر شده از ژن 16S rRNA………………………………………….63
3-20-7- مقایسه توالی نوکلئوتید ژن 16S rRNA سویه‌های اکتینومایست منتخب…………………………….63
4-2- نتایج حاصل از تست ارزیابی سمیت متابولیت‌های ثانویه………………………………………………………..68
4-3- نتایج مربوط به بررسی ریخت شناسی سلول‌ها در تست سمیت سلولی………………………………….. 71
4-4- نتایج مربوط به تست سمیت سلولی با روش MTT……………………………………………………………….72
4-5- بررسی ریخت‌شناسی سلول‌ها پس از تیمار با عصاره سویه‌ی اکتینومیست‌های منتخب………………74
4-6- شناسایی اکتینومیست‌های منتخب………………………………………………………………………………………..74
4-6-1- بررسی ریخت شناسی اکتینومیست‌های منتخب…………………………………………………………………74
4-6-2- تعیین ایزومر DAP موجود در دیواره سلولی…………………………………………………………………… 76
4-6-3- بررسی فیلوژنتیکی اکتینومیست‌های منتخب………………………………………………………………………77
4-6-3-1- تائید استخراجDNA اکتینومیست‌های منتخب………………………………………………………………77
4-6-4- تائید استخراج ژن16S rRNA از ژل آگاروز……………………………………………………………………..77
4-6-4-1- نتایج مربوط به توالی خوانی ژن 16S rRNA……………………………………………………………….78
منابع……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 91
چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………101
پیوست‌ها………………………………………………………………………………………………………………………….102
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 1‑1: میزان شیوع و مرگ و میر ناشی از انواع سرطان در هر دو جنس زن ومرد. 25
جدول 1‑2: تغییرات تنوع سرطان در ایران در طی سال‌های 1376-1318.. 27
جدول 1‑3:گروه‌های مختلف اکتینومیست‌ها 29
جدول 1‑4: تعدادی از متابولیت‌های استخراج شده توسط اکتینومیست‌ها 32
جدول 3‑1:مواد شیمایی استفاده شده 39
جدول 3‑2:دستگاه‌های استفاده شده 42
جدول 3‑3:ترکیبات محیط کشت ISP2 اصلاح شده 44
جدول 3‑4:ترکیبات محیط پیش تخمیر. 45
جدول 3‑5:نمک‌های مورد نیاز برای تهیه آب نمک دریایی مصنوعی.. 46
جدول 3‑6:ترکیبات مورد استفاده درتهیه محیط کشت دودمان A549. 49
جدول 3‑7:ترکیبات محیط کشت… 58
جدول 4‑1:نتایج حاصل از مرحله ی تولید واستخراج متابولیت‌های ثانویه. 64
جدول 4‑2:درصد کشندگی در عصاره‌ها با محدوده اثری بین 40-59% (محدوده اثر خوب). 67
جدول 4‑3:درصد کشندگی در عصاره‌ها با محدوده اثری بین 39-20% (محدوده اثر متوسط). 69
جدول 4‑4:درصد کشندگی در عصاره‌ها با محدوده اثری بین 0-19% (محدوده اثرضعیف). 70
جدول 4‑5: نتایج مربوط به بررسی مرفولوژی سلول پس از تیمار با عصاره‌ها 70
جدول 4‑6: نتایج مربوط به مقایسه مقدار جذب بین عصاره‌ها با شاهد…………………………………………….. 72
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 4‑1:مقایسه میانگین مقدار جذب بین عصاره‌های سویه‌هایی که 05/0≥p داشتندبا شاهد(A549). 73
فهرست اشکال صفحه
شکل 1‑1: ساختمان شیمیایی داکتینومایسین.. 12
شکل 1‑2: ساختمان شیمیایی دانوروبیسین.. 14
شکل 1‑3: ساختمان شیمیایی دوکسوروبیسین.. 16
شکل 1‑4: ساختمان شیمیایی میترامایسین.. 17
شکل 1‑5:ساختمان شیمیایی بلئومایسین.. 18
شکل 1‑6:ساختمان شیمیایی میتومایسین.. 20
شکل 1‑7: ساختمان شیمیایی استرپتوزوستین.. 22
شکل 4‑2: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 863. 74
شکل 4‑3: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 919. 74
شکل 4‑4: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 877. 74
شکل 4‑5: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 676. 75
شکل 4‑6: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 638. 75
شکل 4‑7: مربوط به استخراج DNA اکتینومیست‌های منتخب… 76
شکل 4‑8: مربوط به استخراج ژن 16S rRNA میباشد. 77
فهرست پیوست‌ها
چکیده
در این پژوهش توان تولید ترکیبات ضد سرطان ریه در اکتینومیست‌های بومی ایران که در مرکز کلکسیون میکروارگانیسم‌های دانشگاه تهران(UTMC) نگهداری می‌شوند مورد بررسی قرار گرفت.
ابتدا 40 سویه اکتینومیست که در دمای 70- درجه سانتیگراد نگهداری می‌شدند به صورت تصادفی انتخاب شدند و مراحل اسپورزایی، پیش تخمیر و تخمیر آنها انجام شد. میزان سمیت عصاره‌های استخراج شده به دو روش تست آرتمیا (assay Brine Shrimp) و تست رنگ سنجی (MTT) برروی دودمان سلولی A549 سنجیده شد. پنج سویه UTMC 863،UMC 877 ،UTMC 919 ، UTMC 638، UTMC 676 اثرات کشندگی روی دودمان سلولی A549 داشتند که نتایج تست سلولیMTT، نتایج بررسی ریخت شناسی سلولی را نیز تایید کرد. پنج سویه منتخب تحت شناسایی مورفولوژیک و مولکولی قرار گرفتند. نتایج این بررسی نشان داد که سویه UTMC 676 دارای 86/99% شباهت به Streptomyces aureoverticillatus (شماره دسترسی AY999774) و سویه UTMC 638 دارای 78/98% شباهت به Streptomyces cacaoi subsp. cacaoi (شماره دسترسی AB184115) همچنین سویه های UTMC 863 وUTMC 877 به ترتیب دارای 85/99% و100% شباهت به Nocardia carnea (شماره دسترسی BAFV01000017) و نیز سویه UTMC 919 دارای 29/99% شباهت به سویه Kribbella sancticallisti (شماره دسترسی AM778577) می باشند. باتوجه به اینکه اکتینومیست‌ها توانایی تولید ترکیبات ضد سرطان را دارا می‌باشند،عصاره‌ی سویه‌های تولید کننده بدست آمده در این پروژه فعالیت ضد سرطانی خوبی را نشان دادند . نیاز به کشف داروهای جدید به علت مقاومت دارویی سرطان‌ها هرچه بیشتر احساس می‌شود از این رو پیشنهاد می‌شود عصاره این متابولیت‌ها تخلیص و شناسایی شوند.
کلمات کلیدی: اکتینومیست، غربالگری، دودمان سلولی A549، تست آرتمیا، تست MTT، ترکیبات ضد سرطان
فصل اول:
کلیات
1-1- سرطان
سرطان نوعی بیماری است که در آن کنترل طبیعی مکانیسم های بقاء، تکثیر و تمایز سلول‌ها دچار اختلال می شود. سلول‌هایی که سرطانی شده‌اند، معمولاً آنتی ژن‌های سطحی را بروز می‌دهند که ممکن است از نوع جنینی باشند یا سایر علایم عدم بلوغ را نشان دهند. همچنین ممکن است سایر علائم ناهنجاری‌های کمی و کیفی کروموزمی شامل جا‌‌به‌‌جا‌یی‌‌های مختلف و ظهور توالی‌های تکثیر یافته برخی ژن‌ها بروز کند. امروزه می‌دانیم که زیرمجموعه کوچکی از سلول‌ها موسوم به سلول‌های بنیادین تومور، در داخل یک توده توموری قرار دارند. این سلول‌ها علاوه بر این که دست خوش چرخه‌های مکرر تکثیر قرار می‌گیرند، ممکن است به محل‌های دور دست در بدن مهاجرت کرده و کلنی‌هایی را در اعضای مختلف تشکیل دهند این فرایند، متاستاز نامیده می‌شود. به این ترتیب، این سلول‌های بنیادین تومور توان تشکیل کلنی دارند و مشخصه‌ی آنها، اختلالات کروموزومی است که ناپایداری ژنتیکی آنها را نشان می دهد. ناپایداری ژنتیکی به این سلول‌ها اجازه می‌دهد که نسبت به شیمی درمانی و پرتو درمانی مقاومت نشان دهند. فرایند‌های تهاجمی و متاستاز وهمچنین یک سری اختلالات متابولیک ناشی از سرطان، موجب بیماری و سرانجام مرگ بیمار می‌شوند، مگر آن که بتوان توسط درمان، سرطان را ریشه کن نمود (7).
تعداد صفحه : 129
قیمت :14700 تومان
بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد
و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.
پشتیبانی سایت : * parsavahedi.t@gmail.com
در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.
[add_to_cart id=151872]
